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Dieses Dokument ist Teil der Anfrage „Kommunikation rund um die Auswahl der CPA-Prüfstellen / geeigneten Stellen“
Klinik für Hautkrankheiten
Qualitäts-zertifiziert nach DIN EN ISO 9001:2008
Labor für In-vitro-Forschung und
Routinediagnostik
Universitätsklinikum Jena Klinik für Hautkrankheiten Erfurter Str. 35 07743 Jena
Direktor:
Laborleiter:
Telefon 03641
Telefax 03641
Ansprechpartner:
Telefon 03641
Telefax 03641
web: http:// www.derma.uni-jena.de
28. April 2020
Studienbericht:
Untersuchung auf In-vitro-Zytotoxizität von
Muster 8 / Außenseite
nach DIN EN ISO 10993-5
Bachstraße 18 · 07743 Jena · Telefon 03641 93 00 Universitätsklinikum Jena · Körperschaft des Öffentlichen Rechts
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Klinik für Hautkrankheiten
Qualitäts-zertifiziert nach DIN EN ISO 9001:2008
Labor für In-vitro-Forschung und
Routinediagnostik
Index
Seite
1. Qualitätszertifikat 3
2. Generelles
2.1 Proben 4
2.2 Referenzmaterial 4
2.3 Auftraggeber 4
2.4 Prüfeinrichtung 4
2.5 Durchführungszeitraum 4
3. Zusammenfassung 5
4. Hintergrund 6
5. Material und Methoden
5.1 Extraktherstellung 7
5.2 Anzucht der humanen Keratinozyten 7
5.3 Bestimmung der Zellviabilität und Zellproliferation mittels 8
ATP-Biolumineszenz-Messung
5.4 Bestimmung der Zellproliferation mittels photometrischer 8
Gesamtprotein-Messung
5.5 Bestimmung der Zytotoxizität mittels photometrischer LDH-Messung 9
5.6 Statistik 9
7. Ergebnisse und Diskussion 10
8. Appendix
8.1 Abkürzungsverzeichnis 12
8.2 Tabellen und Abbildungen 13
8.3 Literatur 14
8.4 Messdaten 15
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Untersuchung auf In-vitro-Zytotoxizität von Muster 8 / Außenseite nach DIN EN ISO 10993-5
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1. Qualitätszertifikat
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2. Generelles
2.1 Proben
Muster 8 / Außenseite (Probe erhalten am 17.04.2020)
2.2 Referenzmaterial
-
2.3 Auftraggeber
Ansprechpartner:
2.4 Prüfeinrichtung
Klinik für Hautkrankheiten
Universitätsklinikum Jena
Erfurter Straße 35
D-07740 Jena
Studienleiter:
2.5 Durchführungszeitraum
Start: 20.04.2020 Ende: 27.04.2020
28.04.2020
___________
Datum Studienleiter:
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3. Zusammenfassung
Das Ziel der Studie war die Untersuchung von Muster 8 / Außenseite auf zytotoxische
Eigenschaften in vitro nach DIN EN ISO 10993-5. Dazu wurde aus der Probe ein 24h-Extrakt in
Zellkulturmedium nach DIN EN ISO 10993-12 hergestellt und dessen Wirkung auf
proliferierende, humane Keratinozyten untersucht.
Es konnte gezeigt werden, dass Muster 8 / Außenseite eine sehr gute Zellverträglichkeit
aufweist. In den untersuchten Extraktionsverhältnissen 0,2 g:mL, 0,1 g:mL, 0,02 g:mL und
0,01 g:mL wurde nach 24h Inkubation mit den proliferierenden Zellen kein signifikanter Einfluss
auf die Viabilität der humanen Keratinozyten beobachtet. Der Grenzwert von 70% wurde sowohl
in dem ATP-Assay als auch im BCA-Test nicht unterschritten. Des Weiteren schütteten die
behandelten Keratinozyten nur geringe Mengen an LDH aus. Der Grenzwert für die Zytotoxizität
von 30% wurde nicht überschritten.
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4. Hintergrund
Die Haut stellt die Schnittstelle zwischen unserem Körper und der Umwelt dar. Sie ist funktionell
das vielseitigste Organ des menschlichen Organismus und erfüllt unterschiedliche Aufgaben.
Sie dient der Abgrenzung nach Außen, dem Erhalt der Homöostase, dem Schutz vor
Umwelteinflüssen und ist an Stoffwechselprozessen und immunologischen Vorgängen beteiligt.
Unsere Kleidung hat den längsten und engsten Kontakt mit unserer Haut. Im klinischen und
kosmetischen Bereich werden daher Textilien bereits in vielfältiger Weise genutzt.
Dementsprechend unterliegen sie den Regularien zur Beurteilung und Prüfung im Rahmen
eines Risikomanagementsystems [DIN EN ISO 10993-1]. Materialien die in Kontakt mit
menschlichen Zellen oder Gewebe kommen, müssen als bioverträglich deklariert werden. Die
Prüfung auf In-vitro-Zytotoxizität wird durch die DIN-Norm EN ISO 10993-5 geregelt. Die Proben
können als Extrakte, im direkten Zell/Material-Kontakt oder im indirekten Zell/Material-Kontakt
untersucht werden [DIN EN ISO 10993-5, DIN EN ISO 10993-12]. Die Bestimmung der in vitro
Zytotoxizität ist häufig eine qualitative Analyse, die auf der Untersuchung von Zellschädigung
und Zellwachstum nach Kontakt mit dem Material beruht. Dafür werden verschiedene Zelllinien
verwendet, wobei diese unterschiedlich sensitiv auf entsprechende Materialien reagieren.
Prinzipiell sollten Zellen für die Testung der in vitro-Toxizität eingesetzt werden, die den Zellen
und Geweben einer späteren Applikation entsprechen [Wiegand & Hipler 2009, Wiegand &
Hipler 2008]. Die Biokompatibilität von medizinischen Textilien kann durch weitere zelluläre und
molekulare Faktoren bestimmt werden. Mediatoren, wie z.B. Interleukine, vermitteln die
Zellproliferation, die Zellmigration und mögliche Entzündungsreaktionen. Durch die Analyse der
zellulären Interleukinfreisetzung kann z.B. auf pro-inflammatorische Wirkungen geschlossen
werden, die allein durch Zytotoxizitätsprüfungen nicht nachweisbar wären [Hipler & Wiegand
2011, Wiegand et al. 2010, Wiegand & Hipler 2009, Wiegand & Hipler 2008]. Die Freisetzung
von Lactatdehydrogenase (LDH) ist ein Anzeichen für Zellnekrose, wobei durch die Schädigung
der Zellmembran das Enzym aus dem Zytosol der Zellen freigesetzt wird [Wiegand & Hipler
2009, Wiegand & Hipler 2008].
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5. Material und Methoden
5.1 Extraktherstellung
Nach DIN-Norm EN ISO 10993-12 wurde ein Extraktionsverhältnis von 0,2 g:mL verwendet. Es
wurden 10 g des Testmaterials eingewogen, autoklaviert und in 50 mL Extraktionsmedium für
24 h bei 37°C extrahiert. Als Extraktionsmedium wurde das Zellkulturmedium Dulbecco´s
modifiziertem Eagle’s Medium (DMEM Lot ND09651P, Amimed) eingesetzt, welches mit einer
1%igen antibiotisch- antimykotischen Lösung (Lot LB12602P, Pelobiotech) supplementiert
wurde. Das Testmaterial wurde anschließend abgetrennt, indem der Extrakt über Gaze
zentrifugiert und dann steril filtriert wurde. Danach erfolgte die Supplementierung mit 10% FKS
(fetales Kälberserum, Lot P180902, PAN). Zur Untersuchung des Einflusses der Extrakte auf
humane Zellen in vitro wurde der Originalextrakt mit DMEM in den Verhältnissen 1:2, 1:10 und
1:20 verdünnt, dies entspricht den Extraktionsverhältnissen: 0,1 g:mL, 0,02 g:mL und
0,01 g:mL.
5.2 Anzucht der humanen Keratinozyten
Humane Keratinozyten (HaCaT) wurden in Dulbecco´s modifiziertem Eagle’s Medium (DMEM
Lot ND09651P, Amimed) kultiviert, welches mit einer 1%igen antibiotisch- antimykotischen
Lösung (Lot LB12602P, Pelobiotech) und 10%igem fetalem Kälberserum (Lot P180902, PAN)
supplementiert wurde. Die Kultivierung erfolgte über 7 Tage in 75cm² Zellkulturflaschen
(Greiner bio-one) bei 37°C und einer 5%igen CO2-Atmosphäre.
Für die Versuche wurden die Zellen durch die Behandlung mit Trypsin-EDTA (Lot 2099421,
Gibco) abgelöst und eine Zellsuspension hergestellt. Für die Experimente an den
proliferierenden HaCaT-Zellen erfolgte eine Einsaat von 40.000 Zellen/cm2 in 96-Well-
Mikrotiterplatten (Greiner bio-one). Nach 48h wurde das Medium gegen die Extrakte und
Extraktverdünnungen des Testmaterials ausgetauscht und die Zellen für 1h, 24h und 48h mit
diesen kultiviert. Als Negativkontrollen dienten in beiden Fällen in Medium (DMEM) kultivierte
Zellen. Als Positivkontrolle für eine zytotoxische Wirkung wurde Triton X-100 eingesetzt.
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5.3 Bestimmung der Zellviabilität und Zellproliferation mittels ATP-Biolumineszenz-Messung
Die Bestimmung der Zellproliferation erfolgte auf der Basis der luminometrischen ATP Messung
mit Hilfe des ATPLiteTM-M Assays (Lot 69-18412, PerkinElmer). Der Assay basiert auf der
Produktion von Licht, das bei der Reaktion von ATP mit Luciferase und D-Luciferin entsteht.
Das emittierte Licht ist zur ATP-Konzentration direkt proportional. 50 µL der Zelllyselösung
wurden jeweils zu 100 µL der Zellsuspension pro Well gegeben. Danach wurde 5 min bei 700
rpm im Orbitalshaker geschüttelt. Nach Addition von jeweils 50 µL Substratlösung
(Luciferin/Luciferase) zu jedem Well wurde erneut für 5 min geschüttelt. Danach wurde die
Mikrotiterplatte 10 min im Dunkeln inkubiert und anschließend die Lumineszenz im
Mikroplattenluminometer LUMIstar Galaxy (BMG LabTechnologies GmbH) gemessen. Die ATP-
Konzentrationen wurden auf der Basis einer ATP-Standardkurve ermittelt.
5.4 Bestimmung der Zellproliferation mittels photometrischer Gesamtprotein-Messung
Nach Inkubation der Zellen mit den Proben wurden die Zellen 2x mit PBS gewaschen und dann
10 min mit einer Proteinlyselösung (PBS + 0,1% Triton X) bei 90°C lysiert. Im Anschluss wurden
die Proteinlysate bei -20°C eingefroren. Die Quantifizierung des Gesamtproteingehaltes erfolgte
mit Hilfe des Pierce BCA Protein Assay (Lot UK292595, Thermo Scientific Inc.). Der Assay
basiert auf der Reduktion von Cu²+-Ionen durch Proteine in alkalischer Lösung (Biuret-
Reaktion). Die entstehenden Cu+-Ionen bilden mit Bicinchoninsäure (BCA) einen violetten
Farbkomplex. Dazu werden zu 25 µL Lysat 200 µL BCA-Reagenz gegeben und für 30 min bei
60°C inkubiert. Die Messung der optischen Dichte wurde bei 580 nm im Mikrotiterplattenreader
FLUOstar Galaxy (BMG LabTechnologies GmbH, Offenburg, Deutschland) durchgeführt. Die
Proteinkonzentration wurde anhand einer BSA-Standardkurve ermittelt.
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5.5 Bestimmung der Zytotoxizität mittels photometrischer LDH-Messung
Die Messung der zytotoxischen Wirkung der Probenextrakte erfolgte mittels Cytotoxicity
Detection Kit (Lot 35645500, Roche Diagnostics). Dabei handelt es sich um einen
kolorimetrischen Assay zur Quantifizierung der Zelllyse, basierend auf der Aktivitätsmessung
von Lactatdehydrogenase (LDH), welche bei Zellmembranschädigung aus dem Zytosol in das
Medium freigesetzt wird. Durch das freigesetzte LDH wird im ersten Schritt NAD+ zu NADH + H+
durch Oxidation von Lactat zu Pyruvat umgewandelt. In der zweiten enzymatischen Reaktion
werden 2 H-Atome auf INT (2-[4-iodophenyl]-3-[4-nitrophenyl]-5-phenyltetrazolinsalzchlorid
übertragen und dadurch das gelbe Tetrazolinsalz in ein rotes Formazansalz umgewandelt. Eine
stärkere Schädigung der Plasmamembran resultiert in einem Anstieg der LDH-Aktivität im
Zellkulturüberstand. Dementsprechend ist die Menge des gebildeten Formazansalzes
proportional zur Anzahl der lysierten Zellen. 100 µL des Zellkulturüberstandes wurden vorsichtig
in eine neue 96-Well-Mikrotiterplatte überführt und 100 µL des Tetrazolinfarbstofflösung pro
Well zugegeben. Danach erfolgte ein Inkubationschritt für 30 min bei Raumtemperatur im
Dunkeln. Anschließend wurde die Absorption bei 490 nm im MikroplattenPhotometer FLUOstar
Galaxy (BMG LabTechnologies GmbH) gemessen. Die Zytoxozität wurde im Vergleich zu einer
Positivkontrolle (1% Triton-X 100) ermittelt.
ODProbe - ODMediumkontrolle
Zytotoxizität [%] = x 100
ODPositivkontrolle-ODMediumkontrolle
5.6 Statistik
Alle Messungen erfolgen in Vierfachbestimmungen. Angeben sind die Mittelwerte ±
Standardabweichung. Die statistische Auswertung der Messwerte erfolgte auf der Basis des
Students-T-Test (Microsoft® Excel SP2). Als statistisch signifikant wurden Werte von p < 0,05
bewertet.
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7. Ergebnisse und Diskussion
Die In-vitro-Zytotoxizität der Probe Muster 8 / Außenseite wurde nach DIN EN ISO 10993-5
untersucht. Dementsprechend wurde von der Probe ein 24h-Extrakt in Zellkulturmedium nach
DIN EN ISO 10993-12 hergestellt und dessen Wirkung in den Extraktionsverhältnissen
0,2 g:mL, 0,01 g:mL, 0,02 g:mL und 0,01 g:mL auf die Viabilität von proliferierenden humanen
Keratinozyten sowie die zytotoxischen Effekte in vitro bestimmt.
Es konnte gezeigt werden, dass die Probe Muster 8 / Außenseite nach 48h keinen signifikanten
Einfluss auf die Zellviabilität aufwies. Es wurde für alle Extraktionsverhältnisse eine mit der
unbehandelten Kontrolle vergleichbare Zellzahl mittels luminometrischer Quantifizierung des
zellulären ATP-Gehaltes beobachtet (Abb. 1A). Die photometrische Bestimmung des
Proteingehaltes lieferte übereinstimmende Ergebnisse (Abb. 1B). In beiden Fällen wurde der
Grenzwert von 70% der Kontrolle nicht unterschritten. Des Weiteren wurde keine nennenswerte
Ausschüttung von LDH durch die mit den 24h-Extrakt von Muster 8 / Außenseite behandelten
Keratinozyten gefunden (Abb. 1C).
Dementsprechend weist die Probe Muster 8 / Außenseite nach DIN EN ISO 10993-5 eine sehr
gute Zellverträglichkeit auf. Es wurden keine zytotoxischen Effekte in vitro beobachtet.
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