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Sehr geehrte Frau Schröder, wir nehmen Bezug auf Ihre Anfrage vom 27. Dezember 2023 und bestätigen deren Empfang. Wir weisen darauf hin, dass die Beantwortung Ihrer Anfrage mit Auskünften verbunden ist, an denen Rechte Dritter bestehen, so dass ein Drittbeteiligungsverfahren im Sinne des § 8 IFG notwendig ist und die Monatsfrist des § 7 IFG nicht eingehalten werden kann. Zudem geht der Umfang Ihrer Anfrage bzw. der damit verbundene Verwaltungsaufwand über eine einfache schriftliche Auskunft im Sinne des Gebühren- und Auslagenverzeichnisses zur Informationsgebührenverordnung (IFGGebV) hinaus und wird Gebühren im Rahmen der Ziff. 1.3 der Anlage zur IFGGebV (60 bis 500 Euro) verursachen. Maßstab für die Gebührenbemessung ist primär der Zeitaufwand, bemessen anhand der Personalkostensätze des Bundes. Die Stundensätze betragen für Angehörige des höheren Dienstes 60 Euro, für Angehörige des gehobenen Dienstes 45 Euro und für Angehörige des mittleren Dienstes 30 Euro. Nach einer groben Einschätzung beläuft sich der Zeitaufwand für Angehörige des höheren Dienstes auf 2 Stunden und für Angehörige des mittleren Dienstes auf 1 Stunde. Es würde somit eine Gebühr von 150 Euro entstehen. Vor diesem Hintergrund bitten wir Sie um Mitteilung, ob Sie Ihr Informationsersuchen trotz der zu erwartenden Gebühren aufrechterhalten. Mit freundlichen Grüßen,

Sehr geehrte Frau Schröder, nachdem die Drittbeteiligungsverfahren nunmehr erfolgreich abgeschlossen wurden, möchten wir Ihre Anfrage vom 27. Dezember 2023 wie folgt beantworten: 1. PCR-Testdesigns werden mit unterschiedlichen Zielsetzungen (z.B. Aviäre Influenza, H5, N1, LP und HP, Subtypen u.a.) erstellt. Bitte übersenden Sie mir die von Ihnen verwendeten unterschiedlichen Test-Designs inklusive der Zielsetzung der hierfür verwendeten Primer sowie der dazugehörenden Nachweise zu deren jeweiligen Sensitivität und Spezifität. Die Spezifikationen der Primer und Sonden sowie deren Prüfung analytischer und diagnostischer Sensitivität und Spezifität sind aus der beigefügten Veröffentlichung Hassan et al. (2022) ersichtlich (Anlage 1). 2. Welche ct Werte und welche Viruslast werden den jeweiligen Nachweisgrenzen a) der isolierten RNA b) replikationsfähiger Viren c) der Infektiosität zugeordnet? Sollte Sie Nachweisgrenzen nicht sicher bestimmen (können) geben Sie dies bitte an. Hinsichtlich der Unterpunkte b und c wird kein Unterschied gesehen, da beide Eigenschaften auf der Replikationsfähigkeit im jeweiligen Testsystem (embryoniertes Hühnerei oder Zellkultur) als Maß der Infektiosität der Viren beruhen. D.h. ohne Infektiosität keine Replikation. Für eine Reihe der in Hassan et al. benannten Testsysteme wurden Vergleichswerte auf Basis der Nukleinsäurekopienzahl ermittelt. Hierbei ergab sich für die generisch eingesetzte real time RT-PCR (RT-qPCR) mit dem Zielgen „M“ eine untere Detektionsgrenze von 10-50 Kopien/je Ansatz. Dies entspricht im Vergleich zu Infektiositätsmessungen einer gemittelten Infektiosität von rechnerisch 0.1 Gewebekultur-infektiösen Dosen 50%. RT-qPCRs mit anderen Zielgenen (z.B. H5, H7, H9) ermittelten in den verwendeten Verdünnungsreihen Werte, die denen der M-PCR entsprechen, so dass von einer vergleichbaren Sensitivität der PCRs ausgegangen werden kann. In puncto Spezifität ergaben sich geringgradige Kreuzreaktionen bei wenigen Subtypen (z.B. H7, H15). Durch fortlaufende Optimierung der Primer und Sonden konnten in den aktuell durchgeführten PCRs diese Kreuzreaktionen beseitigt werden (s.a. dazu Hassan et al., 2022). 3. Welche der nachzuweisenden Zielgene mit welchem ct Wert und welcher Viruslast werden für die Generierung der Aussage „auf Geflügelpest (H5N1) positiv getestet“ verwendet? Es werden vier RT-qPCRs parallel eingesetzt, die die Zielgene M, H5, N1 und H52344b_HA haben. Für diese PCRs gelten dieselben Grenzwerte. Typische Befunde sind in Anlage 2 aufgeführt. Darin wurden personenbezogene Daten und Daten, die keinen Sachzusammenhang zu den angefragten Informationen haben (z. B. Referenz-/Originalnummer bzw. Herkunft der Proben) nach Rücksprache mit den Drittbeteiligten geschwärzt. 4. Wie stellen Sie im Arbeitsablauf der RT-qPCR sicher, dass nur RNA von hoher Reinheit (keine Verunreinigungen) und hoher Integrität (nicht abgebaut) verwendet wird? Diese Eigenschaften können bei der Untersuchung klinischer Proben nicht sichergestellt werden, da wir auf die Qualität der zugesandten Proben keinen Einfluss haben. Die RNA-Isolierung erfolgt mit kommerziellen Kits nach festgelegter, akkreditierter Methodik. Eine Einschätzung der Amplifikationsbedingungen in der PCR erfolgt mit Einsatz externer und/oder interner Qualitätskontroll-RNA, die nicht influenza-spezifisch ist. Wird diese Kontroll-RNA nachgewiesen, kann zumindest die Anwesenheit inhibierender Faktoren ausgeschlossen werden und die prinzipielle Funktionalität der PCR gesichert werden. 5. Bitte erklären Sie, wie Sie unterscheiden, ob eine Probe kontaminiert, infektiös oder postinfektiös ist. Eine Untersuchung bzgl. Infektiosität ist aufgrund der gesetzlichen Vorschriften des europäischen Tiergesundheitsrechts nicht erforderlich. Der Nachweis von Bestandteilen des Genoms wird für die Diagnose als ausreichend angesehen. Ein Ausschluss von prozessbedingten Kontaminationen im Rahmen von Nukleinsäureextraktionen erfolgt im Influenzalabor des FLI durch das Mitführen sogenannter RNA-in process-Kontrollen (RICs); hierbei handelt es sich um virusnegative Wasserproben, die sowohl in der Nukleinsäureextraktion als auch in den folgenden PCRs parallel zu den echten Proben mitgeführt werden. Für 7 echte Proben wird eine RIC mitgeführt. Des Weiteren sind in jedem PCR-Lauf eine Negativ- und eine Positivkontrolle enthalten. Die Qualität der Probennahmen kann durch uns nicht kontrolliert werden. 6. Bitte übersenden Sie mir die Protokolle der RT-qPCR -Kalibrierung, welche jeweils für die Messungen 2022AI03792 und 2022AI06146 Gültigkeit hatten. In der Anlage 3 übersenden wir die Rohdaten der PCR-Läufe für die benannten Proben. Diese gehören zu den Aufträgen/Einsendungen 2022-01004 (2022AI03792) und 2022-01638 (2022AI06146). Hier finden sie auch die Daten der Kontrollen: NTC (Negativkontrolle), PTC (Positivkontrolle). Weiterhin haben wir die aufgrund dieser Ergebnisse erstellten Befunde hinzugefügt (Anlage 2). 7. Bitte übersenden Sie mir die jeweiligen Protokolle zur Methodenvalidierung der einzelnen PCR-Testdesigns. Wir weisen darauf hin, dass das Labor von der DAKKS akkreditiert wurde. Damit wird bestätigt, dass die im Labor eingesetzten Methoden und Prozesse den Kriterien nach der ISO-Norm DIN EN ISCVIEC 17025:2018 entsprechen (Nummer der Akkreditierungsurkunde D-PL-14002-02-0). Wie häufig führen Sie eine Methodenvalidierung durch? Die Methoden werden im Rahmen ihrer Entwicklung intensiv validiert; bei Einführung von PCRs aus veröffentlichten Daten anderer Labore wird ein begrenzter Satz von Positiv- und Negativkontrollen eingesetzt. Wie und nach welchen Kriterien erfolgt die Methodenvalidierung? Die Untersuchungen folgen den Vorgaben des Qualitätsmanagement-Handbuchs des FLIs. Inwieweit werden für die Methodenvalidierung berücksichtigt: a) mehrere Geräte gleichen Typs: Gegeben (BioRad Cfx 96 und Nachfolgegeräte in mehreren Exemplaren im Labor verfügbar; eine vierteljährliche interne Validierung der Funktionalität der Cycler ist durch QM abgesichert). b) mehrere Mitarbeiter: Gegeben (mehrere gem. QM Regularien zugelassene Mitarbeitende führen diese Untersuchungen nach Einarbeitung durch). c) verschiedene PCR‐Testkits inklusive der unterschiedlichen Zielgene: Entfällt; gem. den QM-gelisteten Methoden wird nur ein einziger Typ eines Testkits verwendet, mit dem die Validierungen durchgeführt wurden. d) unterschiedliche Geräte-Typen: Entfällt; gem. den QM-gelisteten Methoden wird nur ein einziger Gerätetyp (s. „a)“) verwendet, mit dem auch die Validierungen durchgeführt wurden. 8. Wie häufig und aus welchem Anlass werden jeweils Primerpaar und Sonde an realen Proben (z.B. komplett charakterisiertes Virusisolat) im Labor überprüft? Überprüfungen erfolgen nach abgeschlossener Validierung in der Regel durch Vollgenomsequenzierung hochtitriger Proben aus der Routinediagnostik, wodurch die Nämlichkeit der Identität des durch PCR und Sequenzierung ermittelten Sub- und Pathotyps bestätigt wird. In diesen Sequenzen werden gleichzeitig die Eignung der Primer und Sonden kontrolliert. Pro Monat werden etwa 10-30 Genome sequenziert. Zusätzlich erfolgen Abgleiche der Sequenzen im europäischen Netzwerk der nationalen Referenzlabore sowie mit den in öffentlichen Datenbanken zur Verfügung gestellten Sequenzen, die weltweit erarbeitet wurden. 9. Werden die Messreihen von externen Negativkontrollen sowie Positivkontrollen begleitet? Ja (s. Frage 5). Der Kostenbescheid ergeht mit gesondertem Schreiben. Mit freundlichen Grüßen,

Sehr geehrte Frau Schröder, in der Anlage übersende ich Ihnen unser Antwortschreiben zur Ihrer Nachfrage vom 23.02. Mit freundlichen Grüßen,

Sehr geehrte Frau Schröder, ich habe es leider versäumt, die im Zusammenhang mit Ziff. 1 unseres gestrigen Schreibens in Aussicht gestellten Anlagen beizufügen. Dies hole ich hiermit nach. Mit freundlichen Grüßen,